蛋白質(zhì)印跡是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，用于分析樣品中感興趣的蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解物由細(xì)胞培養(yǎng)物裂解產(chǎn)生，并在凝膠電泳 (SDS-PAGE) 中按重量分離。然后這些蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，在膜上它們被封閉并用特異性抗體探測(cè)以檢測(cè)感興趣的蛋白質(zhì)。借助靈敏且特異的抗體，可以輕松檢測(cè)小樣品中的修飾蛋白質(zhì)或未修飾蛋白質(zhì)。

協(xié)議：

1. 在封閉液（TBST 中的 5% 脫脂牛奶（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.6）中振蕩孵育 1 小時(shí)，封閉膜。

注意：對(duì)于磷酸化特異性抗體，使用封閉液中的 5% BSA。

2. 在封閉液中以適當(dāng)?shù)南♂尪认♂屢豢埂?/span>

3. 將膜與稀釋的一抗在 40°C 下攪拌孵育過夜。

4. 去除抗體溶液。室溫下在 TBST（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.6）中搖動(dòng)洗滌膜 3 次，每次 5-10 分鐘。

注意：將 Tween-20 濃度增加至 0.1% 可降低背景并提高特異性，但會(huì)降低靈敏度。

5. 將膜與在封閉液中稀釋（根據(jù)制造商說(shuō)明）的二級(jí) AP 或 HRP 綴合物一起在室溫下振蕩孵育 1 小時(shí)。

6. 按照步驟 4 清洗膜。

7. 在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)之前，用 TBS 清洗膜 2-5 分鐘。

8. 根據(jù)制造商的說(shuō)明制備和使用化學(xué)發(fā)光底物（用于 AP 或 HRP）。

9. 立即包裹膜并在 X 射線膠片下曝光 10 秒至 1 小時(shí)。暴露時(shí)間可能根據(jù)抗體和抗原的量而變化。或者放入成像儀中并進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。